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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
Bibliografia
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Programma di ricerca

ASPETTI MOTORI E COGNITIVI DELLA FUNZIONE CEREBELLARE
Università di riferimento
Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA - SCIENZE BIOMEDICHE - MODENA(MO)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Leopoldo BON
Descrizione
L'architettura anatomica dei loops cerebellari con la corteccia prefrontale e le evidenze sperimentali di consistenti connessioni tra la corteccia prefrontale e le cortecce uditive, suggeriscono il coinvolgimento del cervelletto ed in particolare del nucleo dentato, nei processi cognitivi, come proposto da Kelly and Stick (2003), nonché la sua integrazione con il sistema uditivo. Inoltre, le connessioni dell'area 9 e 8B con gli strati profondi del collicolo superiore, le proiezioni delle aree 8B e 8A all'area 6 dorsale, e le ulteriori evidenze su consistenti proiezioni tra le aree prefrontali e di queste con l'area 6 dorsale, suggeriscono l'esistenza di un robusta rete di integrazione tra la corteccia prefrontale dorsale e l'area 6 dorsale con il collicolo superiore. Indagini elettrofisiologiche hanno dimostrato la presenza di neuroni la cui attività è correlata con i movimenti dell'occhio e dell'orecchio nelle aree 8B e 8A (Bon and Lucchetti 1994, Schall et al. 1995) e del capo nell'area 8A e nell'area 6 dorsale (Bizzi and Schiller 1970, Bon and Lucchetti 1991 , Sparks et al. 2001), quella di neuroni uditivi nelle aree 9, 8B, 8A e nell'area 6 dorsale (Fuster 2000). Inoltre, è stato dimostrato che la microstimolazione dell'area 6 dorsale evoca incrementi di attività elettromiografica a livello del collo (Schlag and Schalg-Rey 1987, Bon and Lucchetti 1991, Luppino et al. 2003). Tutti questi dati anatomici ed elettrofisiologici suggeriscono una integrazione ulteriore del cervelletto nei processi di orientamento occhio-orecchio e nel controllo dei movimenti della testa.
Lo scopo di questa ricerca è quello di studiare in quale tipo di processi cognitivi è coinvolto il cervelletto. Quindi, si indagherà prima in merito al ruolo svolto dalle aree prefrontali dorsali 9 e 8B, e successivamente dal nucleo dentato del cervelletto nell'orientamento dell'occhio e dell'orecchio e nella funzione di controllo del capo. In particolare si studieranno i processi di memorizzazione delle saccadi, gli aspetti comportamentali delle cellule uditive, il processo di orientamento dell'occhio-orecchio, l'effetto dell'attenzione sulle cellule uditive, la funzione di controllo premotorio e motorio del collo.
Durante il primo anno di attività sperimentale si condizionerà l'animale e si deriverà l'attività dei singoli neuroni dalla corteccia prefrontale. Nel secondo anno si deriverà l'attività unitaria dal cervelletto ed in particolare dal nucleo dentato, e si procederà all'analisi dati ed alla ricostruzione della mappa delle penetrazioni.
Per quanto attiene le interazioni tra le diverse unità di ricerca, questa unità, che intende sviluppare il suo progetto su un modello animale ad alto sviluppo neurologico, potrà senza ombra di dubbio interagire, per quanto attiene gli aspetti cognitivi, con il gruppo della prof. Leggio Maria Giuseppa il cui programma di ricerca verte sugli aspetti cognitivi del cervelletto (memoria ed attenzione) nei pazienti con danno cerebellare. Inoltre, sempre per quanto riguarda gli aspetti cognitivi, potrà trovare interazioni di tipo comparativo anche con l'attività dell'unità diretta dal prof. Guido Livolsi, che si interesserà degli aspetti anatomici delle connessioni cerebellari nel ratto. Infine, visto lo studio vertente sulla funzione cella corteccia prefronate e del cervelletto nel controllo del movimento, sarà di grande interesse l'interazione con l'unità diretta dal prof. Vincenzo Perciavalle che si interesserà di rappresentazione, a livello cerebellare, dei movimenti dell'arto anteriore del ratto.


METODI
Metodi comportamentali
L'attività elettrica di singoli neuroni verrà registrata in una scimmia della specie Macaca fascicularis e verrà testata con: a)l'esecuzione di compiti visuomotori 2) la presentazione di stimoli uditivi in condizione di spontaneità; c) la presentazione degli stessi stimoli uditivi durante la fissazione. I compiti visuomotori saranno i seguenti: 1) fissazione visiva 2) saccadi visive 3) saccadi memorizzate. L'allenamento preliminare sarà eseguito con l'apparato di condizionamento montato sulla gabbia in cui l'animale vive abitualmente. 'animale apprenderà a premere una leva per provocare l'accensione di un LED bicolore (rosso-verde)di luce rossa. Dopo un periodo variabile tra 0.5 e 5.0 s la mira visiva diventerà verde per 0.5 s e l'animale in tale periodo dovrà rilasciare la leva per ricevere il premio, costituito da alcune gocce di acqua dolcificata. Quando l'animale avrà imparato tale compito nella gabbia, verrà posto a sedere in una sedia per primati e portato in una gabbia di Faraday, dove riprenderà l'allenamento sempre con il compito di fissazione. In questa nuova condizione la difficoltà del compito verrà incrementata. L'animale dovrà sempre premere una leva, posizionata in fronte a lui, con l'arto controlaterale all'emisfero da dove si registrerà l'attività unitaria,ed una mira visiva tricolore (rosso-giallo-verde) diventerà rossa (periodo rosso), dopodiché diventerà gialla (periodo giallo) e quindi verde (periodo verde). L'informazione visiva rossa rappresenterebbe il segnale di "attesa" la gialla di "preparazione al rilascio" la verde il comando di "rilascio". Quando le risposte corrette raggiungeranno l'80-90% l'animale sarà allenato per apprendere il compito di saccade visiva. In questo compito più mire visive diventeranno rosse in successione fino all'ultima che diventerà anche verde. Ogni mira visiva diventerà rossa allo spegnimento della precedente. L'animale dovrà rilascire la leva durante il periodo verde per ricevere il premio. Quando si riterrà che l'animale abbia imparato sufficientemente bene i compiti e non mostrerà segni di insofferenza nello stare sulle sedia, sarà preparato per l'impianto del sistema di contenzione indolore e per la derivazione del movimento oculare.
Dopo due settimane dall'intervento l'animale verrà allenato ad eseguire i compiti di fissazione e di saccade, con la testa fissa, finché avrà raggiunto l'80-90% di risposte corrette. Inizierà allora ad imparare il compito di saccade memorizzata. In questo compito, l'animale eseguirà una fissazione verso una mira visiva centrale, dopo 1.0-1.5 s una mira visiva periferica si accenderà per 150 ms. La mira visiva centrale, 1.0 s dopo il flash della mira visiva periferica si spegnerà e l'animale dovrà eseguire una saccade verso la mira periferica per ricevere il premio. Un segnale acustico segnalerà l'inizio del compito e l'animale potrà iniziare a lavorare a suo piacimento. Il segnale acustico resterà acceso durante tutta la successione delle prove e si spegnerà al compimento delle prove corrette. Le mire visive (LEDs) avranno un diametro di 0.05° e saranno posizionate a 114 cm davanti all'animale. Nell'esequzione di qualunque compito, la prova sarà abortita se l'animale farà una extra-saccade.
Gli stimoli uditivi saranno prodotti in laboratorio durante le sedute di allenamento, con l'animale seduto sulla sedia per primati. Gli stimoli uditivi utilizzati saranno; 1) toni singoli generati da tastiera elettronica, 2) un singolo tono seguito da un periodo silente (rotardo) di 150 ms e quindi dal rilascio di alcune gocce di acqua zuccherata come premio; 3) stimoli ambientali: le voci degli sperimentatori come parlato, grida o parole singole, apertura e chiusura delle porte del laboratorio, scalpiccio dei piedi, movimenti delle sedie del laboratorio, passi dei ricercatori in avvicinamento o in allontanamento dall'animale, tamburellamento delle dita o di penne sulle superfici del laboratorio. Si genereranno anche stimoli non usuali come colpi di martello, schioccare delle bretelle, percussione di bicchieri, voci umane non note e vocalizzazioni di animali. Tutti gli stimoli saranno registrati precedentemente e riprodotti mediante quattro altoparlanti posizionati ad una distanza di 100 cm a destra e a sinistra dell'animale, due davanti e due dietro con una angolazione di 45° rispetto alla linea interemisferica. Gli stimoli saranno prodotti a destra, a sinistra od in entrambi i lati. Gli stimoli ambientali e quelli non usuali saranno prodotti anche direttamente in laboratorio, senza l'ausilio degli altoparlanti. L'ultimo test consisterà nella produzione dei medesimi stimoli uditivi mentre l'animale eseguirà il compito di fissazione visiva con l'occhio in posizione primaria. Questa prova permetterà di verificare se l'orientamento volontario dell'attenzione modifica l'attività dei neuroni uditivi.
Inoltre, per verificare se la corteccia prefrontale dorsale (aree 9 e 8B) é coinvolta nel controllo dei meccanismi che regolano la funzione motoria della testa, si studieranno gli effetti delle istruzioni visive ed uditive di tipo preparatorio sulla attività delle cellule correlate agli aspetti funzionali del collo. L'istruzione preparatoria nel compito di fissazione è rappresentata dal giallo, mentre nel test uditivo l'istruzione preparatoria è rappresentata dal ritardo tra il tono ed il premio. Per verificare se la scarica é in relazione al periodo di preparazione oppure alla forza esercitata dall'animale durante il leccamento del beccuccio da cui verrà dato il premio, si userà un Multi Purpose Robot (MUPRO) (Bon et al. 2002), che permetterà di misurare le forze esercitate a livello del capo sul piano orizzontale. Per verificare se esiste una relazione tra scarica e forza, si posizionerà il beccuccio a diverse distanze dalla bocca dell'animale. Inoltre, con il medesimo apparato, si potranno registrare i movimenti passivi ed attivi di rotazione del capo.
Alla fine delle diverse fasi di allenamento, l'animale sarà preparato per la registrazione dell'attività unitaria.
Metodi chirurgici.
In una prima fase, in anestesia generale (Zoletil 10mg/kg i.m, o ketamina 10mg/kg i.m., con 0.1 mg/kg Xylazine i.m.) ed in condizioni di asepsi, verrà applicato un perno di acciaio inossidabile sulla teca dell'animale mediante quattro viti e del cemento acrilico, per permettere la contenzione indolore dell'animale. Allo stesso tempo una spira in acciaio teflonato sarà applicata sotto la congiuntiva oculare, per permettere la registrazione dei movimenti oculari (Judge et al. 1980), e quattro fili in acciaio pure essi ricoperti di teflon saranno inseriti nei muscoli nucali per la derivazione dell'EMG.
Inoltre, nel primo anno, una camera di registrazione, per l'attività unitaria, sarà impiantata a livello della corteccia prefrontale sulla base di coordinate stereotassiche. Nel secondo anno di attività sperimentale, una camera di registrazione sarà impiantata a livello cerebellare per la registrazione dell'attività unitaria dal nucleo dentato.
Dpo ogni fase chirurgica si somministreranno analgesici, antibiotici e cortisonici per due settimane.
Metodi fisiologici ed analisi dati.
I movimenti oculari saranno registrati mediante il sistema del campo magnetico usando il metodo di rilevamento della fase dei campi magnetici (Judge et al 1980; Remmel 1984). La medesima tecnica sarà applicata per derivare i movimenti del padiglione auricolare. In questo caso la spira sarà applicata all'orecchio mediante un sottile nastro autoadesivo all'inizio di ogni seduta sperimentale (Bon and Lucchetti 1994). Questo sistema permetterà di individuare l'inizio e la fine del movimento, ma non potranno essere ottenuti altri parametri poiché il sistema della spira, qui utilizzato, definisce i movimenti in due dimensioni (X-Y), mentre i movimenti dell'orecchio sono in tre dimensioni (X-Y-Z). A complemento verrà usato un sistema televisivo all'infrarosso per osservare i movimenti ed il comportamento dell'animale. Tali dati saranno anche registrati su computer ed inoltre l'EMG, la scarica nervosa e gli stimoli uditivi saranno sopra registrati sul video mediante un miscelatore audio. Gli stimoli uditivi saranno registrati mediante un microfono amplificato ed usati come markers per studiare la sincronizzazione con la scarica nervosa. L'EMG sarà usato per monitorare i tentativi di muovere il capo quando l'animale si troverà col capo fisso. L'attività dei singoli neuroni sarà isolata mediante un sistema multielettrodo (Miniature Fiber-Electrode MiniMatrix-05 ed il sistema di amplificazione, filtraggio e discriminazione MAF-05 entrambi della della Thomas Recording GmbH) per cui si chiede il finanziamento. I movimenti dell'occhio e della pinna, il marker degli stimoli uditivi, l'EMG, l'attività unitaria e le componenti X-Y delle forze del capo saranno campionate ad 1KHz e memorizzate mediante un sistema GWI-Macintosh per l'analisi off-line. Il software SuperscopeII (GWI) sarà utilizzato sia per la registrazione, sia per l'analisi dei dati. Per l'analisi statistica si utilizzerà il test di Wilcoxon (Wilcoxon signed-rank test) per comparare due livelli di una variabile.
Alla fine degli esperimenti, verranno eseguite delle marcature in alcuni siti di penetrazione mediante corrente continua (10µA per 15 s) per la ricostruzione istologica, post mortem, della mappa delle penetrazioni. Alla fine di tutte le sedute sperimentali, sotto anestesia profonda, l'animale verrà perfuso prima con una soluzione allo 0.9% di NaCl e poi con una soluzione di formalina al 5%. Quindi il cervello sarà sezionato in fette di 60µ e colorato con tionina.
Tutte le fasi sperimentali seguiranno gli standard stabiliti dalla Comunità Europea e le vigenti leggi Italiane (D.L. 116/92).
Risultati attesi
Poiché le lesioni dell' area 9 e dell'area 8B non producono deficit consistenti nei compiti di memorizzazione e nella esecuzione di saccadi guidate dallo stimolo visivo, si può supporre che la presenza dei neuroni correlati alle saccadi- memorizzate sia percentualmente scarsa (Petrides 2000, Lucchetti et al. 1997). Risultati consistenti possono essere attesi, invece per quanto concerne i neuroni uditivi viste le evidenze anatomiche ed elettrofisiologiche precedenti. Si può anche ritenere che i neuroni uditivi si attiveranno solo per stimoli ambientali (laboratorio), visto l'alto livello gerarchico di queste aree corticali; mentre i neuroni uditivi-motori saranno attivi sia per gli stimoli uditivi, sia per i movimenti di orientamento dell'occhio e dell'orecchio. Per quanto concerne l'effetto dell'attenzione, si ritiene che l'orientamento dell'attenzione verso una mira visiva possa produrre una inibizione della scarica dei neuroni uditivi o/e uditivi-motori, come è stato dimostrato a livello del collicolo superiore (Bell et al. 2003). Più complessi sono i risultati attesi in merito alla funzione di controllo dei movimenti del capo. E' possibile che esista un vasto repertorio di neuroni con attività specifiche, per esempio: neuroni- premotori, la cui attività potrebbe essere specifica per "cues" premotorie uditive o visive; neuroni motori, la cui attività potrebbe essere in relazione alla forza esercitata dall'animale per leccare il beccuccio erogante il premio; neuroni di posizione la cui attività potrebbe essere in relazione a differenti posizioni del capo sul piano orizzontale; neuroni di movimento la cui attività potrebbe essere in relazione ai movimenti torsionali eseguiti verso stimoli uditivi e visivi di orientamento.
Per quanto attiene alla attività derivata a livello cerebellare si dovrebbero trovare delle attività di scarica che rappresentino delle funzioni di trasferimento delle informazioni codificate a livello della corteccia prefrontale (Lamarre et al. 1983).
Se tali risultati attesi saranno confermati sperimentalmente si capirà meglio in quali processi cognitivi il cervelletto è coinvolto.