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培养基的成分和作用

培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。

1水  是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水,以防成分的变化引起不良效果。 

2无机元素(inorganic element) 
大量元素,指浓度大于0.5mmol/L的元素等。其作用是:
(1)N  是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3—N和NH4—N两种形式供应。大多数培养基既含有N03—N又含NH4—N。NH4—N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。
(2)P  是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分、提供能量,而且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。
(3)K  对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时,蛋白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大,一般为1—3mg/L为好。制备培养基时,常以KCI、KN03等盐类提供。
(4)Mg、S和Ca、Mg  是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4•7H20提供。用量为1—3mg/l较为适宜;Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,常以CaCl2•2H2O提供。 
微量元素  指小于0.5mmol/L的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2SO4,和FeCl3(因其在pH值5.2以上,易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀),而用FeSO4•7H20和Na2—EDTA结合成合物使用。B,Mn,Zn,Cu,Mo,Co等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。 
3有机化合物(organic compound) 
培养基中若只含有大量元素与微量元素,常称为基本培养基(basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类: 
碳水化合物  最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%,常用3%,即配制一升培养基称取30g蔗糖,有时可用2.5%,但在胚培养时采用4%-15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。
不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。高压灭菌时,一部分糖会发生分解,制定配方时要给予考虑。在大规模生产时,可用食用的绵白糖代替。 
维生素(vitamin)  这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动,对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素,但在数量上,还明显不足,通常需加入一至数种维生素,以便获得最良好的生长。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.1—1.0mg/L。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。 
肌醇  (myo—inosltol)又叫环己六醇,在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成,还可进一步生成果胶物质,用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸,植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁,植酸可进一步形成磷脂,参与细胞膜的构建。使用浓度一般为lOOmg/L,适当使用肌醇,能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用,对细胞壁的形成也有作用。 
氨基酸(almino acide)  是很好的有机氮源,可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸,其他的如精氨酸、谷氨酸,谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白,它们是牛乳用酶法等加工的水解产物,是含有约20种氨基酸的混合物,用量在10-1000mg/L之间。由于它们营养丰富,极易引起污染。如在培养中无特别需要,以不用为宜。 
天然复合物  其成分比较复杂,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用,但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚,所以一般应尽量避免使用。 
1)椰乳  是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%—20%,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过1nun时,椰乳就不发生作用。
2)香蕉  用量为150-200ml/L。用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用,对发育有促进作用。
3)马铃薯(potato)  去掉皮和芽后,加水煮30min,再经过过滤,取其滤液使用。用量为150—200g/L。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。
4)水解酪蛋白  为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为100—200mg/L。受酸和酶的作用易分解,使用时要注意。
5)其他  酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%),主要成分为氨基酸和维生素类;麦芽提取液(0.01%~0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定,大多在培养困难时使用,有时有效。 
4植物生长调节物(hormone) 
植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动,在培养基的各成分中,植物生长调节物是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。 
(1)生长素类(auxin)  在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对生长素最敏感。在极低的浓度下,(10-5—10-8rng/L)就可促进生长,其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。
IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小、,高温高压易被破坏,也易被细胞中的1AA分解酶降解,受光也易分解。
NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。
IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。
2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应。
(2)细胞分裂素类 ( cytokinin )  这类激素是腺嘌吟的衍生物,包括6—BA(6—苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强,但非常昂贵,常用的是6—BA。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低。
(3)GA ( gibberellic acid赤霉素)  有20多种,生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基    中添加的是GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株;赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响,当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化,比值低时有利于韧皮部分化;此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后,添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
5培养材料的支持物 琼脂(agar)  在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40~C即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基,就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂的用量在6—10g/L之间,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便,通气问题易于解决,便于经常观察研究等,但它也有不少缺点,如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质,特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时,则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥,然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。 
其他有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等,总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
6抗生物质(antibiotic) 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在5—20mg/L之间。
添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养,效果更好。对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,可能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应。值得提醒的是,在工作中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施。此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。
7活性炭(active carbon) 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它结构疏松,孔隙大,吸水力强,有很强的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小,吸附能力越大。温度低吸附力强,温度高吸附力减弱,甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—l0g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。 
活性炭的应用:
(1)茎尖初代培养,加入适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物,其效力优于Vc和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长,但其作用有一个阈值,一般为0.1%—0.2%,不能超过0.2%。(2)活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性炭减弱光照有关,可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA,但IAA易受可见光的光氧化而破坏,因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA,从而间接促进了根的生长,由于根的生长加快,吸收能力增强,反过来又促进茎、叶的生长。(3)此外,在培养基中加入0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻璃苗有良好作用。(4)活性炭在胚胎培养中也有一定作用,如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭,可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织。

但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶。总之,那种随意抓一撮活性炭放人培养基,会带来不良的后果。因此,在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。


文章来源:http://www.zupei.com/News_ny20701.html

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