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ENFERMEDADES DEL DNA MITOCONDRIAL

 

 

Julio Montoya, Ana Playán, María José Alcaine, José A. Enríquez, Patricio Fernández-Silva, Manuel J. López-Pérez, Francisco Martinez-Azorín, Acisclo Pérez-Martos

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza. Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza.

Financiado por: Dirección General de Enseñanza Superior e Investigación Científica (PB97-1019), Fondo de Investigaciones Sanitarias (98-0049-01) y por la Diputación General de Aragón (P24/97).

 

INTRODUCCION

Las mitocondrias son orgánulos pequeños, del tamaño de una bacteria, que se encuentran presentes en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas y cuya función principal es la producción de la mayor parte de la energía celular en forma de ATP. Las etapas finales de esta generación de energía se producen mediante el sistema de fosforilación oxidativa (sistema OXPHOS), formado por cinco complejos multienzimáticos localizados en la membrana interna mitocondrial y cuyas subunidades proteicas están codificadas en los dos sistemas genéticos celulares, el nuclear y el mitocondrial. La alteración de la síntesis de ATP puede dar lugar a una serie de trastornos que se conocen genéricamente como enfermedades mitocondriales. Hoy en día, este término se aplica fundamentalmente a los defectos en el sistema OXPHOS y mas particularmente a los defectos que son debidos a alteraciones en la secuencia del DNA mitocondrial (mtDNA), por ser los que mayoritariamente se han asociado directamente con estas enfermedades. El mtDNA codifica trece de los polipéptidos del sistema OXPHOS, mientras que el resto de la proteínas están codificadas en el núcleo y se importan finalmente a la mitocondria ensamblándose con los anteriores.

El mtDNA se descubrió en los años sesenta [1], al inicio de los años 80 se describieron las características básicas del sistema genético mitocondrial [2-6] y en 1988 se encontraron las primeras mutaciones en este DNA asociadas a enfermedades [7-9]. Desde entonces, el número de mutaciones en el mtDNA y de fenotipos asociados a ellas ha crecido de modo espectacular y ha generado lo que hoy se podría llamar como una medicina mitocondrial [10,11].

 

EL SISTEMA GENETICO MITOCONDRIAL HUMANO

El mtDNA humano es una molécula circular de 16.569 pares de bases [2]. El número de moléculas de mtDNA varía entre unos pocos cientos en los espermatozoides a unas 200.000 copias en el oocito, pero en la mayor parte de los tejidos el rango está comprendido entre unas 1.000 y 10.000 copias por célula, con 2 a 10 moléculas de DNA por mitocondria. Este genoma contiene información para 37 genes: dos RNA ribosómicos (rRNAs), 22 RNAs de transferencia (tRNAs) y 13 polipéptidos componentes de los complejos multienzimáticos del sistema OXPHOS (siete subunidades del complejo I, una subunidad del complejo III; tres subunidades del complejo IV; y dos subunidades de la ATP sintetasa (complejo V) [12](Figura 1). El resto de las subunidades polipeptídicas componentes de estos complejos así como el complejo II completo están codificados por el genoma nuclear.

La característica estructural mas sorprendente del mtDNA es que los genes se encuentran situados uno a continuación del otro sin apenas nucleótidos intermedios ni intrones. Veintiocho de los genes mitocondriales (2 rRNAs, 14 tRNAs y 12 polipéptidos) se encuentran codificados en una de las cadenas (cadena H), mientras que los 14 restantes (uno polipéptido y 8 tRNAs) lo están en la cadena complementaria (cadena L). La única zona del DNA que no codifica ningún gen es la región del bucle de desplazamiento (bucle-D), localizada alrededor del origen de replicación de la cadena H, en la que se encuentran los promotores de la transcripción y los elementos reguladores de la expresión del DNA. Otra de las peculiaridades de la organización genética del mtDNA es la distribución de los genes de los tRNAs entre los genes de los rRNAs y los codificantes de proteínas. Esta disposición tiene consecuencias muy importantes para el procesamiento del RNA como se indica mas adelante (Figura 1).

Para la replicación del mtDNA hacen falta dos orígenes diferentes (OH y OL), muy separados en la secuencia del DNA, y que hacen que el proceso sea unidireccional y asimétrico. La síntesis del DNA se inicia en OH y la realiza la DNA polimerasa gamma, específica de la mitocondria, que alarga un RNA iniciador formado por procesamiento de un transcrito primario que se sintetiza a partir del promotor L. La replicación continua unidireccionalmente hasta alcanzar OL, momento en el cual comienza la síntesis de la segunda cadena del DNA alargando también un peque–o iniciador de RNA [13,14].

En la transcripción del mtDNA intervienen una RNA polimerasa [15], al menos un factor de transcripción (mtTFA), implicado en la iniciación [16,17], y uno de terminación (mTERF) [18,19]. En invertebrados parece que interviene un segundo factor de transcripción (mtTFB), responsable de la iniciación específica en los promotores [20].

Las dos cadenas del mtDNA se transcriben completamente a partir de tres puntos de iniciación diferentes, dos para la cadena pesada (H1 y H2) y uno para la cadena ligera (L), que originan tres moléculas policistrónicas que se procesan posteriormente por cortes endonucleolíticos precisos en los extremos 5' y 3' de las secuencias de los tRNAs, dando lugar a los rRNAs, tRNAs y mRNAs maduros (modelo de puntuación por el tRNA) [3-6] (Figura 1). Los tRNAs, situados entre los genes de los rRNAs y mRNAs, actúan como se–ales de reconocimiento para los enzimas de procesamiento. En particular, la cadena H se transcribe mediante dos unidades de transcripción solapadas en la región de los rRNAs [6]. La primera de estas unidades, comienza delante del gen para el tRNAPhe (lugar de iniciación H1), termina en el extremo 3' del gen para el rRNA 16S y es responsable de la síntesis de los rRNAs 12S y 16S, del tRNAPhe y del tRNAVal. El factor de terminación (mTERF), unido a una secuencia inmediatamente posterior al gen del rRNA 16S, situada en el gen del tRNALeu [18,19] provoca la terminación de esta unidad. La segunda, mucho menos frecuentemente transcrita que la anterior, comienza cerca del extremo 5' del gen del rRNA 12S (lugar de iniciación H2) y transcribe casi la totalidad de la cadena pesada. El procesamiento de este RNA policistrónico origina los mRNAs de 12 péptidos y los 12 tRNAs codificados en esta cadena. La transcripción de la cadena ligera comienza cerca del extremo 5«del RNA 7S (poli(A)-RNA 18) (sitio de iniciación L) y da lugar a 8 tRNAs, un mRNA y al iniciador de la replicación del DNA.

El aparato de síntesis de proteínas mitocondrial está formado por ribosomas específicos de la mitocondria, cuyos componentes están codificados en el mtDNA (RNA ribosómicos 12S y 16S) y en el genoma nuclear (84 proteínas ribosómicas). En este sistema se sintetizan las trece proteínas codificadas en el mtDNA utilizando para ello un código genético que difiere ligeramente del código genético universal. Así, UGA codifica triptófano en vez de ser un codon de terminación y los codones AUA y AUU se utilizan también como codones de iniciación. Además, los codones mitocondriales se leen solamente con los 22 tRNAs codificados en el mtDNA usando un sistema de apareamiento de bases codon-anticodon mas simple que el del código genético universal.

La biogénesis de la mitocondria depende de la expresión coordinada de los genomas mitocondrial y nuclear pero hasta ahora se conoce muy poco acerca de los mecanismos que regulan la interacción de ambos sistemas genéticos. La expresión del mtDNA parece estar regulada por el factor de iniciación de la transcripción mtTFA, codificado en el genoma nuclear, que activa la transcripción como resultado de su unión al mtDNA [16,17]. Este factor podría ser el responsable tanto de los niveles de RNA como del número de copias de mtDNA ya que la replicación depende de la síntesis de un iniciador de RNA a partir del promotor de la cadena ligera. Como se ha mencionado anteriormente, la regulación de la relación entre rRNAs y mRNAs mitocondriales se realiza fundamentalmente mediante la selección del lugar de iniciación de la transcripción de la cadena pesada [5,6], que a su vez parece que está relacionada con el factor mTERF que causa terminación de la transcripción después de la síntesis de los rRNAs [18,19], y a nivel del procesamiento de los RNAs primarios [4,21,22]. Asimismo, la regulación transcripcional puede realizarse como respuesta a hormonas [23], en particular a hormonas tiroideas que pueden actuar sobre el mtDNA tanto de un modo indirecto a través activación de genes nucleares o directamente sobre el propio mtDNA [24], por estabilidad diferencial de los RNAs maduros [22,25-27], y en el ámbito de la traducción de los mRNAs [28,29].

 

GENETICA MITOCONDRIAL

La genética del mtDNA presenta una serie de caracteres que la diferencian profundamente de la del DNA nuclear. Herencia materna. El mtDNA se hereda exclusivamente por vía materna. La madre trasmite el genoma mitocondrial a todos sus hijos, y solamente las hijas lo trasmitirán de nuevo a todos los miembros de la siguiente generación. La pequeña cantidad de genoma mitocondrial contenido en el espermatozoide raramente entra en el óvulo fecundado y cuando lo hace es eliminado activamente. Poliplasmia: En cada célula hay cientos o miles de moléculas de mtDNA. Segregación mitótica. Durante la división celular las mitocondrias se distribuyen al azar entre las células hijas. Todas las células de un individuo normal tienen el mismo DNA mitocondrial, es decir es una situación de homoplasmia. Si en una célula aparecen dos poblaciones de mtDNA, normal y mutada, se dice que estamos en una situación de heteroplasmia. De esta forma, con la división celular, el fenotipo de una línea celular determinada puede variar originando tres posibles genotipos diferentes: homoplásmico para el DNA mitocondrial normal, heteroplásmico y homoplásmico para el DNA mutado. Efecto umbral. El fenotipo de una célula con heteroplasmia dependerá del porcentaje de DNA dañado que exista en la célula, es decir del grado de heteroplasmia. Cuando el número de moléculas de mtDNA mutadas es pequeño se producirá una complementación de la función con las moléculas de DNA normal y no se manifestará el defecto genético. Sin embargo, cuando el número de copias de DNA mutado sobrepasa un umbral determinado se hará patente un fenotipo patológico. Es decir, si la producción de ATP llega a estar por debajo de los mínimos necesarios para el funcionamiento de los tejidos se produce la aparición de la patogenicidad. Los tejidos dependen en diverso grado de la energía producida por la mitocondria (ATP) y el número de orgánulos y de moléculas de DNA es diferente en cada tejido. Los tejidos que preferentemente se afectan son los mas dependientes de la producción de energía mitocondrial.

Alta velocidad de mutación. La tasa de mutación espontanea del mtDNA es unas 10 veces superior a la del DNA nuclear [30]. Como consecuencia de esto, hay una gran variación de secuencias entre especies e incluso entre individuos de una misma especie. En el hombre se ha calculado que dos individuos escogidos al azar tienen como media unos 50-70 nt de diferencia en su secuencia. Además de estas diferencias, en un individuo determinado se esta produciendo continuamente, a lo largo de la vida, una heterogeneidad en el mtDNA como consecuencia de las mutaciones que se están originando en sus células somáticas. Se ha propuesto que una acumulación de este daño mitocondrial pudiera ser la causa de la disminución en la capacidad respiratoria de los tejidos que tiene lugar en el envejecimiento [31,32]. La variación existente en la secuencia del mtDNA de diferentes individuos es muy útil para estudios antropológicos, etnológicos, y forenses y es la base de la hipótesis de que todos nosotros descendemos de una mujer que vivió en Africa hace unos 200.000 años ("Eva mitocondrial") [33].

 

ENFERMEDADES ASOCIADAS CON MUTACIONES EN EL DNA MITOCONDRIAL

Las enfermedades mitocondriales son un grupo de trastornos asociados con defectos en el sistema de fosforilación oxidativa que conduce a la síntesis de ATP, la ruta final del metabolismo energético mitocondrial. El término fue introducido por Luft en 1962 al describir un paciente con hipermetabolismo no causado por una disfunción tiroidea que presentaba un desacoplamiento de la fosforilación oxidativa en mitocondrias de músculo [34].

Como las proteínas componentes de los complejos multienzimáticos de la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa están codificadas tanto en el DNA nuclear como en el mitocondrial, estas enfermedades pueden estar causadas por mutaciones en los genes de ambos sistemas genéticos. Sin embargo, habitualmente se conoce con el nombre de enfermedades mitocondriales a los daños producidos en el mtDNA, que presentan un tipo de herencia materna, y a ellas nos referiremos en este capítulo.

Las manifestaciones clínicas de estas enfermedades son muy variadas [10,35], entre los mas comunes tenemos: demencia, desórdenes motores, intolerancia al ejercicio, accidentes cerebro-vasculares, convulsiones, ptosis, oftalmoplegia, retinopatía pigmentaria, atrofia óptica, ceguera, sordera, cardiomiopatía, disfunciones hepáticas y pancreáticas, diabetes, falta de crecimiento, anemia sideroblástica, pseudo obstrucción intestinal, nefropatías, estatura corta, acidosis metabólica y otros mas secundarios. En general, son trastornos multisistémicos que afectan fundamentalmente a los tejidos y órganos que mas dependen de la energía mitocondrial (sistema nervioso central, músculo cardiaco y esquelético, riñones y sistema endocrino). Sin embargo, al estar las mitocondrias presentes en todos los tejidos, otros muchos órganos pueden estar implicados en estos síndromes tan heterogéneos. De hecho, una de las pistas que conduce a la sospecha de enfermedad mitocondrial es la implicación de muchos órganos diferentes. Otros caracteres morfológicos y bioquímicos que suelen estar asociados a enfermedades mitocondriales son la presencia de fibras rojo-rasgadas (acumulación de mitocondrias anormales en tamaño y número) en biopsias musculares teñidas con tricromo de Gomori, la presencia de fibras no reactivas a la tinción histoquímica de la citocromo c oxidasa, y defectos en uno o varios complejos de la cadena respiratoria. Sin embargo, algunas enfermedades claramente mitocondriales no presentan estos caracteres tan típicos de los trastornos mitocondriales, especialmente en pacientes en edad pediatrica.

Dada la heterogeneidad de las manifestaciones clínicas, morfológicas y bioquímicas presentes en las enfermedades mitocondriales, su clasificación se basa en las características moleculares y genéticas de las mutaciones. Así, las enfermedades mitocondriales se pueden dividir en dos grandes grupos: Enfermedades asociadas a mutaciones puntuales y enfermedades debidas a reorganizaciones del mtDNA por inserciones y/o deleciones. A continuación se hace una relación de las entidades patológicas mas comunes asociadas a estos tipos de mutaciones.

 

Enfermedades asociadas a mutaciones puntuales

Debido al alto índice de mutación del mtDNA es posible encontrar un gran número de mutaciones puntuales. Sin embargo, la mayor parte de éstas van a ser mutaciones silenciosas que no van a causar ningún tipo de defecto. Para que una mutación pueda ser considerada como patogénica se requiere que cumpla los criterios: que se encuentre en familias afectadas de poblaciones étnicas diferentes, que exista una correlación entre el porcentaje de la mutación y el fenotipo, que segregue junto con el fenotipo y que afecte a una base muy conservada evolutivamente.

Se han encontrado mas de 50 mutaciones puntuales que se localizan en los tres tipos de genes codificados en el mtDNA.

 

Neuropatía óptica hereditaria de Leber.

La neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) fue la primera enfermedad humana heredada por vía materna que se asoció con una mutación en el mtDNA [8]. Está caracterizada por una ceguera bilateral aguda o subaguda, originada por atrofia del nervio óptico, que aparece en la segunda o tercera década de la vida y que afecta más a hombres que a mujeres. Normalmente, los pacientes solo tienen afectada la visión, pero en algunos casos puede ir acompañada de anormalidades en la conducción cardiaca, neuropatía periférica y ataxia cerebelar.

Son muchas las mutaciones puntuales que se han asociado con esta enfermedad (Tabla 1), pero solamente 3 de ellas, las localizadas en los nucleótidos 11.778, 3.460 y 14.484, están consideradas como primarias o patogénicas, siendo la primera de ellas la mas frecuente. El resto de las mutaciones se consideran como secundarias/intermedias y se desconoce su relación directa con la enfermedad. Suelen acompañar a las mutaciones primarias y están siempre presentes en forma homoplásmica. Todas estas mutaciones están localizadas en genes estructurales.

La mayor predominancia de la enfermedad en hombres sugiere que puede existir alguna influencia de un gen nuclear situado en el cromosoma X y, de hecho, en familias finlandesas se ha descrito un ligamiento con el locus DXS7 [36] aunque no se ha confirmado en familias de otro origen.

 

Síndrome de neuropatía, ataxia y retinitiopatía pigmentaria (NARP).

Este síndrome, caracterizado por una debilidad muscular neurogénica, retraso en el desarrollo, neuropatía sensorial, convulsiones, ataxia, demencia y retinopatía pigmentaria y se ha asociado a un cambio T®G en el nucleótido 8.993 de la subunidad 6 de la ATPasa. La mutación se encuentra en forma heteroplásmica y el porcentaje de la mutación se correlaciona con la severidad de la enfermedad.

 

Síndrome de Leigh de herencia materna (MILS)

El síndrome de Leigh es una enfermedad muy heterogénea con trastornos degenerativos multisistémicos que aparece en el primer año de vida. Es una enfermedad muy devastadora que se caracteriza por disfunciones del tallo cerebral y de los ganglios basales, desmielinización, regresión psicomotora, retraso en el desarrollo, convulsiones, ataxia, neuropatía periférica. La presencia de lesiones necróticas cerebrales focales en el tálamo, tallo cerebral y núcleo dentado confirman el diagnóstico. Está producida por la mutación T8993G, la misma que la descrita anteriormente en el síndrome de NARP, pero con un porcentaje de la mutación por encima del 90%. Formas menos severas de esta enfermedad se han asociado con un cambio en la misma posición del mtDNA.

Asimismo, se ha descrito por primera vez una mutación en el gen nuclear de la subunidad flavoproteinica de la succinato deshidrogenasa del complejo II que causa un defecto en la cadena respiratoria mitocondrial [37]. Esta mutación produce un cambio C®T en el nucleótido 1684 (Arg®Trp en el codon 554). Este síndrome puede estar causado también por mutaciones en otros genes nucleares que codifican subunidades de la piruvato deshidrogenasa.

 

Síndrome de encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios de accidentes cerebro-vasculares (MELAS).

Este síndrome se ha asociado en el 90% de los casos con una mutación (A®G) en la posición 3.243 del genoma mitocondrial, localizada dentro de la secuencia del tRNALeu(UUR). MELAS está caracterizado fundamentalmente por accidentes cerebro-vasculares que provocan una disfunción cerebral subaguda y cambios en la estructura cerebral, acidosis láctica y/o presencia de fibras rojo-rasgadas. Estos caracteres pueden ir acompañados también de encefalomiopatía con convulsiones generalizadas, dolor de cabeza, sordera y demencia. Esta enfermedad se han relacionado también con otras mutaciones localizadas en el tRNALeu(UUR) que parece ser muy propenso a sufrir mutaciones patogénicas (Tabla1). La mutación principal, en la posición 3.243, se ha relacionado también con otras enfermedades muy distintas como oftalmoplegia progresiva externa, cardiomiopatías e incluso con diabetes mellitus y sordera, por lo que la relación genotipo-fenotipo no es muy fija.

 

Síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojo-rasgadas (MERRF)

MERRF es un síndrome de herencia materna caracterizado por epilepsia mioclónica, debilidad muscular, ataxia, convulsiones generalizadas y miopatía mitocondrial con presencia de fibras rojo-rasgadas. Otros síntomas menos comunes son demencia, sordera, neuropatía, atrofia óptica, fallo respiratorio y cardiomiopatía. Puede aparecer tanto en la infancia como en edad adulta y es de curso progresivo. El 80-90% de los casos de MERRF están asociados con la presencia de una mutación A®G en la posición 8.344 del gen del tRNALys, pero en algunos casos se han encontrado también otras mutaciones en el mismo tRNA. Recientemente, se ha demostrado utilizando híbridos transmitocondriales (células r0 repobladas con mitocondrias con la mutación 8.344) que la mutación produce una disminución de la síntesis de proteínas mitocondriales originada por una deficiencia en la aminoacilación del tRNALys [38].

 

Otras enfermedades asociadas a mutaciones puntuales en el mtDNA.

Además de las mutaciones puntuales descritas anteriormente, se han encontrado un buen número de mutaciones puntuales asociadas a otros muchos síndromes (Tabla 1). Entre ellos podemos citar la diabetes de herencia materna con sordera que afecta a 1«5% de la población diabética [39,40]; las cardiomiopatías de herencia materna; LHON y distonía; miopatías de herencia materna unidas a mutaciones en tRNALeu, tRNAPro, tRNAAsn, tRNATyr; la sordera inducida por aminoglicósidos y otros tipos de sordera sindrómica o no-sindrómica de herencia materna; anemia sideroblástica; deficiencia fatal de la cadena respiratoria infantil, etc. Recientemente, nuestro laboratorio se ha descrito una familia española con el síndrome de lipomatosis simétrica múltiple asociada a la mutación 8.344 del gen del tRNALys que no presenta ninguna de las características típicas de MERRF [41]. En la Tabla 1 se citan otras mutaciones que se han asociado a estos u otros síndromes y, sin ninguna duda, el espectro de fenotipos relacionados con mutaciones en el mtDNA aumentará mas en el futuro. Se está estudiando el papel que pueden jugar el daño en el mtDNA en enfermedades neurodegenerativas como Parkinson y Alzheimer [42-44]. Asimismo, en nuestro laboratorio se está investigando la posible relación de la inefabilidad masculina con daños en el mtDNA debido a la gran dependencia que tiene la motilidad de los espermatozoides de la función de la cadena respiratoria.

 

Enfermedades asociadas a reorganizaciones del mtDNA

Algunos pacientes con enfermedades que afectan al sistema OXPHOS presentan mutaciones originadas por reorganizaciones del mtDNA. Estas pueden deberse tanto a deleciones como, menos frecuentemente, a inserciones (duplicaciones). Este tipo de mutaciones, al contrario que las mutaciones puntuales, suelen ser espontáneas aunque hay descrito algún caso de herencia materna. Hasta el momento se han descrito varios cientos de reorganizaciones del mtDNA. Son heteroplásmicas y pueden aumentar la gravedad con la edad. Se han descrito una amplia variedad de síndromes clínicos, algunos de los cuales se describen a continuación.

 

Síndromes de oftalmoplegia externa progresiva (PEO).

La oftalmoplegia externa progresiva crónica está caracterizada por oftalmoplegia, ptosis bilateral de los párpados y miopatía. Además, suele ir acompañada de intolerancia al ejercicio y debilidad muscular. En el músculo se encuentran fibras rojo-rasgadas y COX negativas. En general, es una enfermedad benigna que suele aparecer en la adolescencia o en adultos jóvenes. Aparece de forma esporádica sin historia familiar. Se ha asociado fundamentalmente a deleciones grandes y únicas en mtDNA (ver mas adelante). Asimismo, se han encontrado otras formas de PEO con mutaciones puntuales de herencia materna (Tabla 1) o con deleciones múltiples de herencia autosómica dominante.

Síndrome de Kearns-Sayre.

El síndrome de Kearns-Sayre es una enfermedad multisistémica progresiva que aparece antes de los 20 años de edad y que está caracterizada clínicamente por PEO y retinopatía pigmentaria. Además suele ir acompañada de otros síntomas como ataxia, miopatía mitocondrial, bloqueo de la conducción cardiaca, elevados niveles de proteína CSF (fluido cerebro espinal) por encima de 100 mg/dl, sordera y demencia, fallos endocrinos y renales. La biopsia muscular muestra fibras rojo-rasgadas. Los pacientes suelen morir antes de los 40 años. Esta enfermedad está asociada a la presencia de deleciones grandes únicas en el mtDNA (ver mas adelante). No se han encontrado deleciones en la madre de los pacientes por lo que parece que la aparición de las deleciones es esporádica.

 

Síndrome de Pearson.

El síndrome de médula ósea-páncreas de Pearson es una enfermedad de los primeros años de vida que afecta a la hematopoiesis y a la función pancreática exocrina. Las características clínicas mas comunes son anemia sideroblástica con vacuolización de precursores de la médula ósea que se manifiesta con una anemia macrocítica, trombocitopenia y neutropenia. Los niños afectados suelen morir antes de los 3 años y los que sobreviven suelen desarrollar mas tarde un fenotipo de Kearns-Sayre. Estos pacientes presentan deleciones grandes únicas del mtDNA, en general son esporádicas aunque se ha descrito algún caso de herencia materna [45].

Estos tres síndromes, PEO, Kearns-Sayre y Pearson, tienen en común el presentar grandes deleciones (de 2 a 9 Kb) en el mtDNA que suelen aparecer de forma espontánea. En general, estas deleciones son únicas pero también se han descrito deleciones múltiples [45,46]. Hay dos tipos de deleciones, de 4.997 y 7.436 pb, que se presentan con mayor frecuencia (deleciones comunes). La mayor parte de las deleciones están flanqueadas por secuencias de repetición directa (alrededor de un 70%), pero otras no lo están. En general, están localizadas en el arco grande comprendido entre los orígenes de replicación, nunca se pierde el OH e incluyen varios genes del mtDNA. Esta pérdida de genes, especialmente la de los tRNAs, hace que estos genomas no se puedan traducir y, por tanto, son dependientes de complementación con moléculas de mtDNA normales en la misma mitocondria. El umbral se alcanza cuando el porcentaje de moléculas delecionadas supera el 60%.

La presencia de estas deleciones se detecta con relativa facilidad por la técnica de hibridación Southern en la que se encuentran poblaciones de mtDNA de menor tamaño que el normal (16.569 pb). Las deleciones son siempre heteroplásmicas, pueden llegar a constituir un porcentaje muy alto de la población de mtDNA y se encuentran en varios tejidos. Su determinación se hace fundamentalmente en biopsias de músculo pero, si la afectación es muy grave, se pueden llagar a detectar también en sangre.

Existen otras muchas enfermedades que están asociadas a la presencia de grandes deleciones en el mtDNA. Entre otras se puede mencionar los fenotipos de diabetes, sordera y atrofia óptica; miopatías en general; el síndrome de encefalomiopatía mitocondrial neurogastrointestinal (MNGIE); el de diabetes mellitus, diabetes insípida, atrofia óptica y sordera (DIDMOAD), etc. Asimismo, existen síndromes que presentan grandes deleciones en el mtDNA que se trasmiten de forma autosómica dominante o recesiva. Esta forma de herencia sugiere la existencia de genes nucleares que pueden afectar a la estructura del mtDNA. Entre ellos cabe mencionar una oftalmoplegia externa progresiva crónica autosómico dominante [47].

 

Duplicaciones del mtDNA.

En algunos pacientes con defectos en la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa se han encontrado duplicaciones parciales del mtDNA, unas veces solas y otras acompañadas también con deleciones. Pueden ser esporádicas [48] o de herencia materna [49], la mayoría de los fenotipos que producen no se diferencian de los que producen las deleciones y la gravedad de la enfermedad aumenta con los niveles de moléculas con duplicaciones. Es posible que el número de duplicaciones sea mayor que el hasta ahora descrito por la dificultad de distinguir moléculas duplicadas y delecionadas mediante el método de hibridación Southern mencionado anteriormente, ya que producen el mismo patrón electroforético de tipos de moléculas.

Se han encontrado duplicaciones en pacientes de Kearns-Sayre, Pearson, diabetes mellitus, tubulopatía renal y miopatía mitocondrial [48-53]. También se han encontrado duplicaciones e incluso triplicaciones en individuos normales [54,55]. El mecanismo por el cual se producen las duplicaciones y causan patogenicidad no está nada claro todavía.

Deleciones múltiples en el mtDNA.

Como se ha mencionado anteriormente, se han encontrado familias con PEO que presentan deleciones múltiples de herencia autosómico dominante [46,47,56] o recesiva [57], así como otros casos de diversa sintomatología (mioglobinuria recurrente, encefalopatía gastrointestinal mitocondrial, miositis con cuerpos de inclusión) aunque alguno de ellos puede presentar una herencia materna.

El modelo de herencia autosómico dominante sugiere la existencia de mutaciones en genes nucleares implicados en la biogénesis mitocondrial y mantenimiento del mtDNA que pueden causar mutaciones en este genoma, es pues un defecto en la comunicación núcleo-mitocondria. Se ha encontrado que adPEO puede estar causado por un gen localizado en el cromosoma 10q en una familia finlandesa y en el 3p en familias italianas [58,59], pero todavía no se han encontrado los genes o factores específicos que las producen.

 

Depleción del mtDNA.

La depleción es una disminución en los niveles de mtDNA. Como el caso anterior, es un trastorno de herencia mendeliana que afecta a la coordinación núcleo-mitocondria, y que parece ser autos—mico recesivo. El defecto puede ser debido a mutaciones en genes nucleares que controlan el número de copias del mtDNA. Se desconoce por el momento cual puede ser el gen responsable pero se ha encontrado que pacientes con depleción tenían también bajos niveles del factor de transcripción mtTFA [60,61]. El origen nuclear del defecto se ha confirmado al introducir mitocondrias de un paciente en células r0 carentes de mtDNA. El nuevo entorno nuclear restauraba los niveles de mtDNA [62].

El espectro clínico que produce la depleción de mtDNA puede ser muy variado. Los casos descritos hasta ahora son fundamentalmente de niños con combinaciones variables de miopatía, nefropatía o hepatopatía, miopatía infantil fatal por fallo respiratorio y algún otro con implicación multisistémica. Asimismo, parece ser la causa de una miopatía mitocondrial que aparece en pacientes de SIDA después de tratamiento prolongado con AZT. El diagnóstico se realiza por el método de hibridación Southern comparando los niveles de mtDNA con los de DNA nuclear.

 

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

Para poder realizar el diagnóstico de las enfermedades mitocondriales es necesario basarse en estudios clínicos, morfológicos, bioquímicos y de genética molecular [35]. Desde el punto de vista clínico, y debido a que las mitocondrias se encuentran en todos los órganos y tejidos, se puede predecir que estamos ante una enfermedad mitocondrial cuando el paciente presente síntomas neuromusculares y/o no neuromusculares asociados con un curso progresivo rápido y con la implicación de órganos o tejidos no relacionados entre si. La aparición de la enfermedad puede comenzar a cualquier edad, incluso a los pocos días del nacimiento. Algunas asociaciones de caracteres clínicos son mas frecuentes a determinadas edades y se pueden identificar como entidades diferenciadas, lo que indica que estas asociaciones no son fortuitas. En general, existe mucho solapamiento de síntomas que lo hace muy difícil la clasificación clínica y la delimitación de los síndromes.

Entre los análisis que se deben de realizar se incluyen las determinaciones de lactato, piruvato y cuerpos cetónicos como índice del estado de oxido-reducción. Para ello es muy importante la recogida y mantenimiento de la muestra de sangre. De excepcional importancia son las determinaciones de consumo de oxígeno en fracciones enriquecidas de mitocondrias y de actividades enzimáticas en homogenados de tejidos que indicarán la posible deficiencia de actividad de uno o varios complejos del sistema OXPHOS. Para estos análisis es muy importante que el tejido a analizar sea aquel en el que se expresa la enfermedad. Es muy importante realizar estudios morfológicos del músculo con el fin de buscar la posible presencia de fibras rojo-rasgadas por la tinción tricromo modificada de Gomori. Sin embargo, la ausencia de esta característica morfológica no excluye el diagnóstico de enfermedad mitocondrial. También se pueden llevar a cabo diversas tinciones histoquímicas para enzimas oxidativos como la detección de actividad COX en fibras individuales. La resonancia magnética nuclear ha permitido identificar diversos modelos de implicación del sistema nervioso central.

Una de las características que mas ayudan al diagnóstico es la observación de una herencia materna de los síndromes. Este hecho, unido a los resultados de los análisis anteriores, indicará si se debe analizar la posible presencia de mutaciones en el mtDNA. Para estos análisis se puede utilizar muestras de sangre o biopsias musculares. Las primeras son suficientes para la mayoría de la mutaciones puntuales, aunque se deben de realizar también los análisis en músculo donde en muchos casos la expresión de la mutación es mayor. En el caso de deleciones, es fundamental el poder realizarlo en músculo ya que es posible que están ausentes en la sangre.

 

MODELOS CELULARES PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES MITOCONDRIALES.

Se conoce muy poco acerca de la relación entre las manifestaciones de una enfermedad con los defectos genético-moleculares descritos anteriormente. Por tanto, es preciso realizar estudios que permitan determinar si la mutación encontrada es una mutación patogénica y como interfiere a nivel molecular con la fisiología celular y tisular. En la actualidad no existen modelos animales de estudio pero, sin embargo, en el laboratorio de Giuseppe Attardi se ha desarrollado una tecnología muy importante para el conocimiento del efecto que producen las mutaciones en el mtDNA [63,64]. Esta tecnología consiste en la obtención de líneas celulares transmitocondriales formadas por células normales repobladas con mitocondrias de pacientes con mutaciones en el mtDNA. Para ello, en primer lugar hay que preparar líneas celulares a las que se les ha eliminado el mtDNA por tratamiento con dosis bajas de bromuro de etidio. Estas células llamadas r0, se fusionan posteriormente con citoplastos, células a las que se les ha quitado el núcleo, de un paciente determinado. Los cíbridos transmitocondriales resultantes contendrán mitocondrias con mtDNA dañado en un medio núcleo-citoplásmico normal. Estos cíbridos se pueden caracterizar tanto a nivel bioquímico como molecular para detectar los mecanismos moleculares responsables de la patogenicidad. De este modo, se ha podido mostrar que las mutaciones que originan los síndromes de MELAS y MERRF producen una reducción muy marcada de la actividad respiratoria y de la síntesis de proteínas [38,65,66]. Es más, en el caso de la mutación 8.344 que causa MERRF, se ha demostrado además la presencia de proteínas truncadas como consecuencia de una falta de aminoacilación del tRNALys donde se encuentra la mutación [38].

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido subvencionado por la Dirección General de Enseñanza Superior e Investigación Científica (PB97-1019), Fondo de Investigaciones Sanitarias (98-0049-01) y por la Diputación General de Aragón (P24/97).

 

 

Enviar correspondencia a:

Dr. Julio Montoya Villarroya

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Miguel Servet, 177

50013 ZARAGOZA

Teléfono: 976761640

FAX: 976761612

E-mail: jmontoya@posta.unizar.es

Montoya

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111.- Nelson I, Hanna MG, Alsanjari N, Scaravilli F, Morganhughes JA and Harding AE. A new mitochondrial DNA mutation associated with progressive dementia and chorea: A clinical, pathological, and molecular genetic study. Ann Neurol 1995; 37: 400-403.

112.- Hao HL, Bonilla E, Manfredi G, Dimauro S and Moraes CT. Segregation patterns of a novel mutation in the mitochondrial tRNA glutamic acid gene associated with myopathy and diabetes mellitus. Am J Hum Genet 1995; 56: 1017-1025.

 

TABLA 1.- Mutaciones puntuales en el mtDNA y enfermedades asociadas.

Enfermedad

 

Enfermedad

Mutación en el mtDNA

Gen afectado

Referencias

Muraciones primarias

G3460A

G11778A

T14484C

ND1

ND4

ND6

[67,68]

[8]

[69]

Mutaciones Intermedias

G5244A

G15257A

ND2

Citocromo b

[70]

[70]

Mutaciones Secundarias

T3394C

T4160C

T4216C

A4917G

G7444A

T9101C

G9438A

G9804A

G13708A

G13730A

G14459A

G15812A

ND1

ND1

ND1

ND2

CO I

ATPasa 6

CO III

CO III

ND5

ND5

ND6

Citocromo b

[69]

[71]

[72]

[72]

[73]

[74]

[75]

[75]

[72]

[76]

[77]

[70]

NARP

T8993G

ATPase 6

[78]

Leigh (MILS)

T8993G

T8993C

ATPase 6

ATPase 6

[79,80]

[81]

MELAS

A3243G

C3256T

T3271C

T3291C

T9957C

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

COIII

[82]

[83]

[84]

[85]

[86]

MERRF

A8344G

T8356C

tRNALys

tRNALys

[87]

[88]

Diabetes y Sordera

A3243G

tRNALeu(UUR)

[39]

Cardiomiopatía

A3260G

C3303T

A4269G

A4300G

A4317G

C4320T

G8363A

T9997C

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

tRNAIle

tRNAIle

tRNAIle

tRNAIle

tRNALys

tRNAGly

[89]

[90]

[91]

[92]

[93]

[94]

[95]

[96]

Miopatía Mitocondrial

T3250C

A3302G

C15990T

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

tRNAPro

[97]

[98]

[99]

Sordera inducida por aminoglicosidos

A1555G

12S rRNA

[100]

Sordera sensoneural

T7445C

tRNASer(UCN)

[101]

Anemia sideroblástica

G12301A

tRNALeu(CUN)

[102]

Lipomatosis múltiple simétrica

A8344G

tRNALys

[41]

PEO

A3243G

A5692G

G5703A

C3256T

tRNALeu(UUR)

tRNAAsn

tRNAAsn

tRNALeu(UUR)

[103]

[104]

[105]

[105]

LIMM

A15923G

tRNAThr

[106]

Muerte súbita

A3251G

tRNALeu(UUR)

[107]

Necrosis Bilateral del estriado

T9176C

T8851C

ATPase 6

ATPase 6

[108]

[109]

Multisistémicas

A3251G

A3252G

C3256T

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

tRNALeu(UUR)

[107]

[110]

[105]

Corea y demencia

G5549A

tRNATrp

[111]

LHON y Distonía

G14459A

ND6

[77]

Diabetes y Miopatía

T14709C

ND6

[112]

LIMM: miopatía mitocondrial infantil letal; LHON: Neuropatía óptica hereditaria de Leber; MELAS: encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios de accidentes cerebro vasculares; MERRF: Epilepsia mioclónica con fibras rojo-rasgadas; MICM: Cardiomiopatía de herencia materna; MILS: Síndrome de Leigh de herencia materna; PEO: oftalmoplegia progresiva externa. ND: subunidades de la NADH deshidrogenasa; CO: subunidades de la citocromo C oxidasa. (Volver al texto)

 

Figura 1.- Mapa genético y de transcripción del DNA mitocondrial humano. En la parte interior se muestran las dos cadenas del DNA mitocondrial con los genes que codifican: rRNAs (rRNAs 12S y 16S), tRNAs, y secuencias codificadoras de proteínas (ND: subunidades de la NADH deshidrogena; cyt b: apocitocromo b; CO: subunidades de la citocromo C oxidasa). Los círculos exteriores indican la posición de los RNAs (transcritos de la cadena pesada y ligera: barras negras y barras abiertas, respectivamente). H1, H2 y L indican los sitios de iniciación de la transcripción de la cadena pesada y ligera, respectivamente. OH y OL simbolizan el origen de replicación de la cadena pesada y ligera. (Volver al texto)