Autore Bruno Pacifici

La colorazione di Gram

 

Nel 1883-4 il Dr H.C.Gram, un fisico che lavorava con R.Koch, scoprì che i batteri sono divisibili in due categorie che si colorano sequenzialmente con cristal-violetto seguito da un bagno di soluzione iodo-iodurata., un bagno con un agente decolorante e un colorante per la conta. Un gruppo di cellule resisteva alla rimozione del cristal violetto con il decolorante etanolo o acetone, mentre il secondo gruppo si decolorava rapidamente. Per vedere quest’ultimo gruppo lo espose brevemente all’azione di un colorante quale la safranina. Le cellule che conservavano il cristal violetto risultavano blu e sono dette Gram-positive e le altre rosa, dette Gram-negative.

 

Gram e collaboratori realizzarono quindi che la colorazione era differenziale e secondariamente diagnostica e poteva essere usata per identificare  cellule e  sostanze.

Terzo, capirono che le cellule batteriche e  i loro componenti differivano chimicamente. Queste conclusioni portarono all’idea dei proiettili magici e successivamente Fleming a capire il significato della penicillina.

 

cellwall.gif (4556 bytes)Oggi sappiamo perché si colorano differentemente. Clicca  qui  

 

Per una buona riuscita della colorazione è importante la quantità di batteri che viene posta sul vetrino, né troppa né troppo poca. Anche l’età della coltura è importante. Cellule molto giovani o molto vecchie producono scarsi risultati, mentre quelle di media età e cresciute in buone condizioni daranno risultati attendibili. Il mezzo stesso sul quale è stata fatta crescere la coltura può influenzare la riuscita della colorazione perché si riflette sulla natura chimica della cellula.

La durata dei vari passaggi, la qualità dei reagenti e l’esperienza delle persone che fanno le procedure influenza il risultato finale.

 

Mentre molti batteri sono “chiaramente” G+ o G- un largo numero è in qualche modo variabile.

Procedura:

I reagenti per l’operazione sono:

 

     Cristal Violetto (il colorante primario)

 

 

     Soluzione iodo-iodurata (il mordente)

     decolorante (l’etanolo)

     Safranina (il colorante secondario)

     Acqua

 

                        

 

 

 

Prima di iniziare, assicurarsi che tutti i reagenti e l’acqua siano accessibili nelle immediate vicinanze perché non avrai tempo di andarle a prendere durante la procedura.  Il campione deve essere fissato.

                                                                                                              

STEP 1: Poni il vetrino su un supporto dove possa scolare il liquido che metterai. Copri completamente il vetrino col cristal-violetto e lascialo agire per 60 secondi. Quindi lava per 5 secondi con acqua. Il preparato deve apparire blu-violetto.

 

 

 

 

STEP 2: Adesso bagna il vetrino con la soluzione iodo-iodurata e lasciala agire un altro minuto. Trascorso il tempo lava 5 secondi con acqua e passa alla tappa 3. Il campione sarà ancora blu-violetto.

 

 

 

 

 

STEP 3: In questo passaggio si usa il decolorante, l’etanolo. Per sicurezza aggiungere l’etanolo per gocce fino a che il colore blu-violetto non è andato via. Come nei passaggi precedenti lava con acqua per 5 secondi.

 

 


STEP 4: Si usa la safranina. Bagna il vetrino e lascia il liquido per 1 minuto in modo che i batteri lo assorbano. I Gram positivi non lo incorporeranno e rimarranno blu-violetti. I Gram negativi invece si coloreranno di rosa e saranno quindi distinguibili. Di nuovo lava per 5 secondi con acqua per rimuovere l’eccesso di safranina.

 

 

 

Adesso tampona con carta assorbente o lascia asciugare all’aria prima di vedere il vetrino al microscopio.