ELEKTRONINĖ MIKROSKOPIJA

Dr. Sonata Šalomskaitė-Davalgienė

            Žiūrėk kaip nori, gyvenimas – keistas daiktas. Baisiai keistas. Pavyzdžiui, neginčytina, jog mes visi sudaryti iš visiškai tokios pat materijos, kaip ir protingiausios, kūrybingiausios, įstabiausios visatos būtybės. Maža to, mes susidedame iš lygiai tokių pat atomų struktūrų kaip ir aukščiausi planetos kalnai ar šviesiausios Galaktikos žvaigždės...

                                                Bradley Trevor Greive. Tai, kas tas gyvenimas?

Žmogaus gyvenimas – tai didelis eksperimentas su daugybe hipotezių arba lygtis su daugybe nežinomųjų... Kiekvienas pasirenka savo kelią: ieškot sprendinių, tikrinti hipotezes ar tiesiog atsiduoti likimo srovei...Jei nutarei eksperimentuoti, vadinasi, nutarei rasti nežinomąjį – perskaityti straipsnį apie elektroninį mikroskopąJ

Elektroninis mikroskopas yra sudėtingas prietaisas, kurio pagalba atliekami, ne tik morfologiniai tyrimai, bet ir nustatoma stebimų objektų cheminė sudėtis.

Istorija

XIX a. Antrojoje pusėje, ir ypač XX amžiuje, buvo sparčiai plėtojami histologiniai tyrimo metodai. Pramoniniu būdu pradėti gaminti mikrotomai, tobulėjo fiksacijos, medžiagos kietinimo ir dažymo būdai.

Apie 1950 metus, ištobulėjus labai plonų pjūvių technikai, elektroniniu mikroskopu buvo pasiekta skiriamoji galia iki 0,1 nm. Be transmisinių elektroninių mikroskopų (kai elektronų srautas pereina pro superploną 60-80 nm storio tiriamą objektą), buvo sukonstruoti nuskaitomieji (skenuojamieji) elektroniniai mikroskopai, kuriais gauti trimačiai tiriamojo objekto paviršiaus vaizdai. Storiems pjūviams (1-5 nm) tirti sukonstruoti didelės įtampos (iki 3 000 000 V) elektroniniai mikroskopai, kuriais galima analizuoti trimatį ląstelės struktūrų vaizdą. Siekiant elektroniniu mikroskopu pamatyti fiksacijos ar kietinimo procesų neiškreiptą audinių vaizdą, sukurtas užšaldytų nuolaužų metodas. Lūžio vietoje, plyšus ląstelės membranai, tarsi atsiveria jos vidus ir matomos organelės.

Pirmasis elektroninio mikroskopo prototipas buvo sukurtas 1931 metais vokiečių inžinierių Ernst Ruska ir Max Knoll. Šis kūrinys sukurtas remiantis prancūzų fiziko Louis de Broglie idėjomis ir atradimais. Nors elektroninio mikroskopo prototipas ir buvo paprastas bei netiko praktiniam naudojimui, jis tiriamus objektus galėjo didinti iki keturių šimtų kartų.

Reinhold Rudenberg Siemens tyrimų direktorius, užpatentavo elektroninį mikroskopą 1931 metais, nors tuo metu kompanija Siemens ir neatlikinėjo tiriamųjų darbų elektroniniu mikroskopu. 1937 metais Siemens ėmė finansuoti Ruska ir Bodo von Borries darbą, kuriant elektroninį mikroskopą. Siemens taip pat įdarbino Ruska brolį Helmut, kuris dirbo šio mikroskopo pritaikyme, tiriant biologinius objektus.

1930 – ųjų metų dešimtmetyje Manfred von Ardenne pirmasis sukūrė nuskaitomąjį (skenuojantį) ir universalų elektroninį mikroskopus.

Siemens pirmąjį komercinį TEM pagamino 1939 metais, nors pirmasis praktiniam naudojimui sukurtas mikroskopas 1938 metais Toronto universitete Eli Franklin Burton ir studentų Cecil Hall, James Hillier ir Albert Prebus.

Nors šiandieniniai modernūs elektroniniai mikroskopai ir didina tiriamus objektus iki dviejų milijonų kartų, jie paremti Ruska sukurtu prototipu. Tyrėjai naudoja elektroninį mikroskopą biologinei medžiagai (pavyzdžiui, mikroorganizmams ir ląstelėms), didelių molekulių struktūrai, biopsijų pavyzdžių, metalų ir kristalų struktūroms ir įvairių paviršių ypatybėms tirti.

Elektroninės mikroskopijos išskiriamos dvi pagrindinės rūšys, tai:

·         Transmisinė elektroninė mikroskopija

·         Skenuojanti elektroninė mikroskopija.

Plačiau aptarsime transmisinės elektroninės mikroskopijos ultraplonų pjūvių metodą.

Optinį mikroskopą sudaro šviesos šaltinis, kondensorius, fokusuojantis šviesą į objektą, objekto laikiklis (stalelis), objektyvas ir okuliaras. Tokia pati schema yra ir elektroniniame mikroskope, išskyrus tai, kad šviesa yra pakeista elektronų srautu, vietoj stalelio objektiniam stikliukui padėti yra metalinis tinklelis, o vietoj stiklinių lęšių yra elektromagnetinės lęšiai (1. pav.).

1. Pav. Optinio (A)ir elektroninio (B) mikroskopų sandaros schema.

Apšvietimui naudojant elektronus, labai padidėja elektroninio mikroskopo skiriamoji galia. Elektronų srautai įgreitinami aukštos elektros įtampos. Susidaro didelis potencialų skirtumas tarp anodo ir katodo. Elektronų srautas yra valdomas elektromagnetiniais laukais, kuriuos sukuria elektromagnetiniai lęšiai. Elektromagnetinis lęšis – tai ritė su keliais tūkstančiais vielos vijų. Elektros srovė, tekėdama per V formos volframinės vielos katodą, įkaitina jį iki 2500 ºC ir sukeliama elektronų emisija. Elektronai, veikiami aukštos įtampos tarp katodo ir anodo, dideliu greičiu lekia anodo link. Praskrieję pro anodo centre esančią angą, elektronai, fokusuojami elektromagnetinių kondensorinių lęšių, apšviečia tiriamą objektą. Didesnė elektronų srauto dalis praeina pro tiriamą objektą ir suformuoja vaizdą. Dalis elektronų yra išsklaidoma paruošto tiriamo objekto sunkiųjų metalų atomų ir yra sulaikoma apertūtinės diafragmos. Toliau skriejantys elektronai fokusuojami objektyvinio lęšio, kuris padidina vaizdą iki 150 – 200 kartų. Projekciniu lęšiu vaizdas padidinamas ir projektuojamas liuminescenciniame ekrane. Tai ekranas, padengtas fluorescuojančiomis medžiagomis ir, patekus į jį elektronams, ima švytėti. Elektroninio mikroskopo (2. pav.), taip vadinama, optinė sistema yra vakuume. Vaizdo formavimas priklauso nuo tiriamo objekto pjūvio storio bei objekto molekulinio tankumo. Dėl elektronų srauto mažo skvarbumo, tyrimams turi būti atplauti ultraploni pjūviai (~ 50 nm), o tam reikalingas specialus ultramikrotomas, deimantinis peilis bei specialus ultraplonų pjūvių paruošimas. Kalbant apie elektroninį mikroskopą, šios sąlygos priskiriamos prie jo trūkumų kaip ir tai, kad reikalingas vakuumas – vadinasi, gyvų ląstelių tyrimams elektroninis mikroskopas netinka.

2. Pav. Šiuolaikinis elektroninis mikroskopas.

Histologija (gr. histos – audinys, logos – mokslas) – tai mokslas, tiriantis daugialąsčių gyvūnų ir žmogaus audinių formavimąsi, struktūrą, funkcijas bei audinių pasiskirstymą organuose. Yra išskiriamos keturios audinių grupės: epitelinis audinys, jungiamasis audinys, raumeninis ir nervinis audiniai. Šiandien histologija suprantama ne vien kaip mokslas apie audinius. Šiandien tai mokslas, tiriantis gyvūnų ir žmogaus organizmo mikroskopinę struktūrą bei nagrinėjantis struktūrų ryšį su funkcija. Taigi, histologija yra kaip tik ta sritis, kurioje elektroninio mikroskopo pagalba yra ypač reikalinga. Histologijos tyrimų objektas – tai audinių histofiziologijos, augimo, regeneracijos dėsningumų aiškinimas. Tiriamas audinys yra puiki medžiaga, kuri gali būti ruošiama tyrimams elektroniniu mikroskopu.

            3 ir 4 paveikslėliuose pateiktos makrofagocitų nuotraukos. Antrajojo paveikslo nuotrauka pateikta, stebint pro šviesos mikroskopą, o trečiojo paveikslo nuotraukos yra darytos, stebint elektroniniu mikroskopu. Skirtumas akivaizdus! Tad, norėdami ištirti ląstelės viduląstelines struktūras, tiriamą medžiagą turime paruošti analizei elektroniniu mikroskopu.

3 Pav. Nekrozės poodyje vietoje matyti makrofagų infiltracija (geltona rodyklė).

 4 Pav. A. Fibroblastocitai puriajame jungiamajame audinyje. C, Kolageno fibrilės; G, Goldži kompleksas; N, branduolys; Nu, branduolėlis; RER, grūdėtasis endoplazminis tinklas. 12 000 x B. Putlioji ląstelė. CT, jungiamasis audinys; G, citoplazminės granulės; N, branduolys. 7 000 x C. Makrofagocitas, prarijęs eritrocitą. E, eritrocitas; L, lizosoma; M, makrofagocitas; N, branduolys; R, retikulinė skaidula. 9 000 x D. Makrofagocitas, prarijęs neutrofilą. NP, neutrofilas; PE, makrofagocito ataugos. 13 500 x.

            Tiriamojo objekto paruošimas

1. Tiriamasis objektas

·         biologinės medžiagos paėmimas (narkozė, perfuzija, prefiksacija)

·         paimtos medžiagos smulkinimas (gabalėlio dydis 0.5 – 1 mm)

2. Fiksacija

·                                 Fiksatorius

Osmio tetraoksidas – lipidams, aldehidai – baltymams

Formaldehidas – citoplazmai, smulkiems organoidams

Glutaraldehidas – citoplazmai, smulkiems organoidams

Kalio permanganatas – membranoms

·         Buferis

Fosfatinis, kakodilatinis, veronalacetatinis, bikarbonatinis, kolidino

·         Buferio pH 7.3 – 7.4

·         Fiksavimo temperatūra

·         Fiksavimo trukmė

2 – 4 val. Aldehide

1 val. Osmio tetraokside

                        3. Dehidratacija

·         Laipsniškumas

·         Dehidratacijai naudojamos medžiagos

Metanolis, etanolis, acetonas,propileno oksidas

4. Įliejimas

·         Naudojamos dervos

Metakrilatai (Lowicryls)

Epoksidinės dervos (aralditas, eponas, spurr)

Polieterinės dervos (vestopal W)

5. Pjovimas ultramikrotomu

·         Pjaunami pusiau ploni pjūviai – 1 μm

·         Blokelis paruošiamas pjovimui

·         Blokelis paruošiamas pjovimui ultramikrotomu

·         Pjovimas ultramikrotomu

·         Pjūvių surinkimas

6. Dažymas

·         Osmio tetraoksidu

·         Uranilacetatu

·         Švino citratu

·         Fosforovolframine rūgštimi, kai pH > 3

·         Fosforovolframine rūgštimi, kai pH < 3.

Taigi, trumpai pristačius tiriamojo objekto paruošimą mikroskopavimui elektroniniu mikroskopu, matome, kad nėra taip paprasta pasiekti tokį rezultatą, koks pateiktas penktajame paveiksle. Tačiau mokslas niekada nebuvo ir nebus paprastu gyvenimo keliu!

            Mokslas nebuvo ir niekuomet nebus užbaigta knyga. Kiekvienas svarbus laimėjimas iškelia naujų klausimų, o visokia raida ilgainiui susiduria su naujais, kaskart didesniais sunkumais.

A.    Einšteinas

Literatūra

1. Vitkus A. ir kt. Žmogaus histologija. Kaunas. 2003
2. Michael H. Ross, Wojciech Pawlina. Histology. A text and atlas. USA. 2006.

Internetiniai tinklalapiai:

1.                  http://pathology.tmu.edu.tw

2.                  http://www.visualhistology.com

3.                  http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope

4.                  http://www.engr.uky.edu