实验方法
- 铁蛋白免疫电镜技术
| 实验方法原理 | 免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 |
一、材料与试剂准备 1. 马脾铁蛋白 2. 硫酸铵 3. 硫酸镉 4. 双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)：以0.30 mol/L pH9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。 5. 0.30 mol/L pH9.5硼盐酸缓冲液 6. 0.1 mol/L 硫酸铵液 7. 0.05 mol/L pH7.4 PBS液 二、操作方法 1. 铁蛋白的提取 （1） 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液中。 （2） 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。 （3）1 500 g离心(4℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸铵至100 ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。 （4）于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。 （5） 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。 （6）以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。 （7）重复步骤⑹一次。 （8） 以少量蒸馏水溶解，常水透析24 h后，以0.05 mol/L pH7.5 PBS透析24 h。 （9） 100 000 r/min离心2 h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。 （10）用微孔滤膜(孔径0.45 μm)过滤，使铁蛋白含量为65 mg/ml～75 mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存，以免铁蛋白结构遭破坏。 2. 铁蛋白－抗体交联 （1） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20 mg/ml～25 mg/ml。 （2）以1︰1 000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45 min，离心去沉淀。 （3） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5 mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48 h。 （4）以0.1 mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05 mol/l pH7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。 （5） 超速离心 以1.00×10 5 g离心5 h，去上清，沉淀以0.05 mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。 （6） 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。 3. 铁蛋白－抗体结合物处理标本 （1） 将标本以5%福尔马林pH7.2(4℃)PBS液固定40 min～60 min。 （2） 用冷的PBS液洗涤，离心。 （3） 如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20 min，不时振荡。 （4） 以冷PBS液洗涤三次，离心。 （5） 沉淀以2.5%戊二醛固定20 min，以PBS洗涤。 （6） 再以锇酸固定，脱水包埋。 也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下： （1） 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。 （2）PBS液洗涤离心。 （3） 以0.5 ml，30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3 h。 （4）取出，切成小块，以PBS液洗涤。 （5） 置干燥器中以硅胶干燥。 （6） 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。 （7） 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。 （8） 5 min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。 （9）凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。 三、结果判定 在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。 |
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
发表于2007-01-28 17:35
实验方案的问题在以下几点： 1. 匀浆的时候，不应该用水，而应该用缓冲液，因为匀浆的过程中，pH条件变化比较大，蛋白很容易变性。 2. 除杂蛋白的温度有问题，你可以尝试一下不同的温度，至于时间，我觉得10分钟左右应该足够了。 3. 我觉得应该离心，再过滤比较好，从实验设计上来看，这样应该合理一些。 4. 硫酸铵沉淀，不能按照他所说的，因为每100ml的蛋白浓度不一样，所以加的硫酸氨也应该不一样，这个应该根据你自己的实验而定。 5. 硫酸铵沉淀后，应该用缓冲液溶，因为在透析过程中，本来就有盐浓度和ph的变化，能引起蛋白的局部变性，所以不应该用水。
发表于2004-04-06 18:13
铁蛋白是一种分子量较大的蛋白质，是铁的主要贮存形式，铁蛋白的测定适用于了解体内铁代谢的情况。铁蛋白测定以400 ng/ml为正常上限，某些肿瘤常常升高且大于此值，常见于：急性白血病、何杰金氏病、肺癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌。检测铁蛋白对肝脏转移性肿瘤有诊断价值，76%的肝转移病人的铁蛋白含量高于400 ng/ml，与AFP联合检测，尤其是AFP正常的肝癌患者，可提高诊断率。
发表于2007-10-01 02:18
实验问答
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